Микробиоту кишечника называют новым органом в теле человека. О других мы знали давно, но о том, что бактерии выполняют важные для человека функции, стало известно только в конце XX века.
Мы решили рассказать, как происходило изучение микробиоты и какие методы используют для этого сейчас.
С чего началось изучение микробиоты
В XVII веке создатель микроскопа и «отец микробиологии» Антони Ван Левенгук впервые рассмотрел и описал бактерии полости рта и фекалий. Тогда он назвал их «анималькули».
В 1828 году Кристиан Эренберг вводит новый термин Bacterium. В тот момент он изучал кишечную палочку (Escherichia coli) — вид бактерий без спор. Для спорообразующих бактерий Кристиан придумал термин Bacillus. Этот вид бактерий активно изучал Роберт Кох. Он же выявил взаимосвязь между патогенными представителями этого рода и заболеваниями, такими как сибирская язва и туберкулез.
Уже в XIX веке исследователям было понятно, что здоровье человека тесно связано с бактериями. Однако полноценно изучать микробиоту стало возможно после открытия технологии секвенирования генов Фредериком Сенгером. В чашках Петри способны жить и расти далеко не все виды, поэтому подробно классифицировать и определить функции бактерий было сложно.
Одновременно с развитием технологий в 70-х годах микробиолог Карл Вёзе предложил классифицировать микроорганизмы на основе секвенирования молекулы 16s рРНК, по которой удобно определять степень родства. По данным анализа Карл разделил все микроорганизмы на археи, бактерии и эукариоты. Эта классификация используется и сейчас.
Эукариоты отличаются наличием ядра, а у бактерий и архей его нет. Археи — это простые одноклеточные микроорганизмы, которые живут в экстремальных условиях — в гейзерах, на дне морей и океанов. А еще они самые древние: археи существуют на Земле примерно четыре миллиарда лет.
Среди архей нет паразитарных и патогенных микроорганизмов, а среди бактерий есть, но не так много, как нам кажется — около 1%.
В кишечнике человека археи производят метан. Также чем их больше, тем ниже риск ожирения, но причинно-следственная связь остается неясной. Археи есть далеко не у всех и редко выходят за пределы 1–2%.
Бактерии живут в самых разных средах и мы контактируем с ними намного больше, чем с археями. Они отличаются рядом функций. Например, бактерии могут разрывать молекулы углеводов и производить жирные кислоты, а археи — нет.
Как изучают микробиоту
Перед тем, как погружаться в исследования, давайте сначала освежим знания о работе ДНК, РНК и синтезе белка.
Для правильной работы организму нужны белки. Тканям кожи, чтобы поддерживать защитную функцию — требуются одни; клеткам глаз, чтобы орган работал правильно — другие. Иногда разным клеткам и тканям требуется один и тот же белок. Чтобы создавать белки, клетки используют ДНК как инструкцию.
Сначала определяется участок, в котором содержится нужная информация. Двуспиральная ДНК разматывается и копируется только одна ее сторона. Затем ДНК сматывается обратно, а копию ее одной стороны (РНК) подхватывает рибосома. Она считывает последовательность и строит по ней цепочку аминокислот, которая потом приобретает форму и становится белком.
Это можно сравнить с готовкой по старинной книге рецептов. Сначала мы выписываем рецепт, чтобы не использовать лишний раз хрупкую, но ценную книгу. Далее по рецепту мы соединяем разные продукты, как рибосома аминокислоты, чтобы получить готовое блюдо.
Для клетки блюдо — белок, который она использует дальше для своих нужд. Кроме белка микроорганизмы производят другие соединения, например жирные кислоты, которые считаются метаболитами.
Для изучения микроорганизмов в основном используют четыре подхода: метагеномное — исследование ДНК, метатранскриптомное — изучение РНК, метапротеомика — изучение белков, метаболомика — изучение метаболитов.
Метагеномное секвенирование
Какие организмы находятся в образце и какие функции они потенциально выполняют
Обычно под исследованием микробиоты имеют в виду именно этот тип анализа, потому что его первым стали масштабно использовать для изучения бактерий. После появления технологии секвенирования ДНК ученые запустили глобальный проект по изучению почв, морей, горячих источников.
Благодаря метагеномному анализу, база данных микроорганизмов росла в геометрической прогрессии. Секвенирование позволяет изучать бактерии в естественной среде, тогда как в лабораторных условиях многие из них погибают.
В 2007 году исследователи США начали проект по изучению микробиома тела человека Human Microbiome Project. Он стал толчком к масштабному изучению состава бактерий кишечника на основе метагеномных данных. Вслед за HMP в Европе в 2008 году запустили похожий проект — MetaHit.
Анализ не позволяет напрямую оценить, какие соединения производит сообщество бактерий. Однако мы можем прогнозировать это опосредованно. Например, если у человека много бактерий-производителей масляной кислоты — скорее всего, его микробиота хорошо ее вырабатывает.
Метагеномные исследования получили широкое распространение потому, что их проще провести в сравнении с другими методами. Для изучения РНК, белков и метаболитов требуется сложная очистка образцов и более трудоемкие анализы.
По метагеномным данным мы имеем больше всего результатов. Это наглядно видно по базе научных статей и клинических исследований PubMed. Поиск по запросу metagenomic microbiome выдает около 9600 различных статей, запрос metatranscriptomic microbiome — 600, metaproteomic microbiome — 350, а metabolomic microbiome — 3200.
Метатранскриптомное секвенирование
Какие микроорганизмы активно участвуют в работе микробиоты
Транскриптом — совокупность всех молекул матричной РНК (мРНК), которые синтезирует одна клетка или группа микроорганизмов. При метатранскриптомном анализе изучают непосредственно РНК, а не ген, который ее кодирует.
Бывает так, что бактерия есть, но она никак не участвует в жизни микробного сообщества: у нее есть неактивные гены, которые не копируются молекулой РНК. Метатранскриптомные исследования позволяют оценить именно активную часть микробиоты. Однако молекула РНК не так стабильна, как ДНК, и быстро распадается. Поэтому выделить и сохранить ее для анализов сложнее и дороже.
Часто транскриптомные исследования используют для изучения определенных функций генов. В таком случае результаты исследования РНК сверяют с метагеномными данными. Так ученые получают более полную информацию о работе микроорганизмов.
Метатранскриптомные исследования микробиома могут быть полезны, чтобы точнее определить потенциал к синтезу различных соединений.
Метапротеомика
Какие белки производят микроорганизмы
При таком подходе изучаются все белки, которые находятся в образце. Метапротеомика дает информацию о структуре, функциях и динамике микробного сообщества. Ученые узнают больше о том, как организмы взаимодействуют друг с другом, соревнуются за питание, производят метаболиты.
Сначала из образца выделяют белки. Затем проводят дополнительный анализ для определения молекулярной массы. Так мы получаем информацию о фрагментах белка (пептидах), но не о белке целиком. Чтобы собрать осколки в единое целое, используется специальные программы, и ученые получают готовые данные.
Метопротеомика в настоящий момент менее популярна, чем исследование ДНК и РНК. Это связано со сложностью проведения исследований и высокой вероятностью ошибки. В образце может быть много белков человека или еды. Однако метапротеомика может помочь ученым пролить свет на взаимодействия между бактериями и нарушения работы микробиоты у людей с заболеваниями.
Метаболомика
Какие соединения кроме белков производят микроорганизмы
При таком типе анализа исследуются метаболиты — вещества, которые бактерии производят. Это могут быть аминокислоты, липиды, сахара, жирные кислоты, в том числе масляная, и другие соединения.
Описано около 40 000 метаболитов тела человека, и все они зафиксированы в большой базе данных.
В качестве образца для исследования метаболитов можно использовать любую жидкость из тела человека: кровь, слюну, мочу, кишечный лаваж (смыв) и даже спинномозговую жидкость. В среднем в плазме крови содержится около 4200 метаболитов, в моче — 3000, спинномозговой жидкости — 500, а слюне — 400. Однако для исследования микробиоты в качестве биоматериала используют лаваж.
Процедура исследования метаболитов похожа на анализ белков. С начала метаболиты выделяют, а затем измеряют их молекулярную массу с помощью масс-спектрометра.
Исследование метаболитов имеет свои ограничения. Мы не можем узнать точно, какие метаболиты выделяет именно микробиота кишечника, а какие поступили с пищей.
Невозможно также подсчитать, сколько тех или иных бактерий содержится в микробиоте. Поэтому для более полной картины данные по метаболитам сопровождаются результатами метагеномных анализов. Такой подход иногда используют, чтобы изучить, как микробиота и ее метаболиты участвуют в развитии заболеваний.
Что нужно запомнить
Пока ни один метод исследования микробиоты не используется в регулярной клинической практике. Иногда для полной картины врач может порекомендовать провести именно метагеномное исследование микробиоты, чтобы оценить состав бактерий кишечника.
Мы не советуем проводить исследование детям, потому что по их микробиоте данных намного меньше. А лишнее вмешательство и ограничение рациона детей — потенциально опасно, так как ребенок может недополучать необходимых нутриентов или пострадать от гипердиагностики.
Сегодня жителям России и стран СНГ предлагают исследование метаболитов микробиоты для детей и взрослых по образцу крови или слюны методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии. По его результатам, как утверждают разработчики этого метода, можно оценить наличие и отсутствие воспалений в организме.
Однако в международных клинических гайдлайнах нет подобных рекомендаций. Диагностика воспалений и заболеваний должна проводиться методами, которые имеют высокий уровень доказательности, определенную степень чувствительности, низкую вероятность ложноположительных результатов и осложнений гипердиагностики.
Чтобы узнать, какие бактерии живут в вашем кишечнике, в Тесте микробиоты мы используем наиболее изученную технологию 16S рРНК.
